Příběh dvou barvení: Ponceau S vs Coomassie Blue

Pokud po procházení celého protokolu není váš band tam, kde ho očekáváte, možná budete muset vyřešit problémy s protilátkami, ale měli byste také vyřešit elektroforézu a kroky přenosu. To lze provést vizualizací celkového proteinu barvením Ponceau S nebo Coomassie.

Barvicí roztok Ponceau S a barvivo Coomassie Brilliant Blue Stain umožňují vizualizaci přenosů proteinů po elektroforéze. Jsou důležité pro potvrzení přenosu proteinu a přítomnosti cíle zájmu, což šetří čas a cenné zdroje ve vašich experimentech. Kromě toho vykazují jakékoli nedokonalosti skvrn, jako jsou bubliny a nerovnoměrný přenos, což jsou důležité faktory při snaze o snímky v publikační kvalitě.

Barvy Ponceau S i Coomassie Brilliant Blue jsou negativně nabité roztoky, které se vážou na kladně nabité aminokyselinové skupiny a nepolární proteinové oblasti. Ponceau S detekuje hladiny bílkovin při 200 ng a vyšších a je kompatibilní s PVDF, nitrocelulózovými nebo nylonovými membránami. Tradiční Coomassie Brilliant Blue je kompatibilní pouze s PVDF membránami, ale dokáže detekovat hladiny proteinů při 50 ng a vyšších. Detekční barvivo s vyšší citlivostí může být důležité v závislosti na typu vzorku a prováděném testování. Použití roztoku Coomassie Brilliant Blue však brání možnosti pokračovat v analýze WB, protože alkoholy a kyseliny přítomné v roztoku způsobují fixaci vzorků proteinů v gelu po použití.

Protokol barvení Coomassie Blue G-250

K dispozici je několik typů barvicích roztoků Coomassie Brilliant Blue a protokoly se mírně liší, v závislosti na prodejci a typu roztoku trvají od dvou hodin až po celý den. Jeden z nejběžněji používaných Coomassie Blue G-250 lze použít následovně:

• Po elektropřenosu promyjte polyakrylamidový gel třikrát ddH2O.
• Přidejte alespoň 25 ml (nebo dokud není gel pokryt) barvícího roztoku na polyakrylamidový gel.
• Umístěte gel s barvícím roztokem na šejkr a pomalu protřepávejte, aby se gel nepřichytil k nádobce.
• Doba barvení se liší v závislosti na tloušťce gelu a procentu akrylamidu. Může trvat dvě hodiny nebo déle, než uvidíte na gelu jednotnou modrou barvu.
• Poté, co byl gel obarven, promyjte gel ddH2O a jemně protřepávejte jednu až dvě hodiny, přičemž mezitím několikrát vyměňte ddH2O, abyste odstranili přebytečné volné barvivo.

Protokol barvení Ponceau

Barvicí protokol Ponceau S trvá asi 20 minut, je netoxický a je šetrnějším řešením než Coomassie Brilliant Blue. Barvicí roztok Ponceau S nefixuje protein, což umožňuje analýzu WB po barvení, což je další klíčová úvaha.

Chcete-li použít Ponceau S (CST #59803):

• Po elektropřenosu na membránu krátce opláchněte membránu v ddH2O.
• Inkubujte membránu v barvicím roztoku Ponceau S po dobu pěti až deseti minut při pokojové teplotě.
• Promývejte membránu v ddH2O po dobu jedné až pěti minut, dokud nebudou viditelné červené pruhy.
• Proužky lze poté označit nebo vyfotografovat před opláchnutím membrány několika promytími 1X TBS-T po dobu pěti minut.

Experiment nyní může pokračovat a veškeré zbytky Ponceau S budou smyty během kroku blokování. Kromě toho Ponceau S neinteraguje s vazbou protilátky.

Kdy použít Ponceau S vs Coomassie Brilliant Blue

Celkově mohou obě řešení pomoci zaručit vaše výsledky. Pokud potřebujete detekovat množství bílkovin v rozmezí 50-200 ng, Coomassie Blue je vaše nejlepší volba.

V Cell Signaling Technology je však Ponceau často naší nejlepší volbou kvůli své rychlosti, snadnému použití a jemné, ale účinné povaze.