10 tipů pro šťastné buňky

1. Zajistěte, aby všechny laboratorní materiály byly sterilní.

Křížová kontaminace je největším nepřítelem buněčné kultury. I sebemenší kontaminace může zničit týdny výzkumu. Houby snadno rostou díky teplým a vlhkým podmínkám inkubátoru, proto je důležité se o ně starat a pravidelně ji čistit. Kromě toho otřete čisté lahvičky s médiem, pipety a další související materiály etanolem před jejich umístěním do digestoře s vaší kulturou, abyste se vyhnuli této frustraci.

2. Zacházejte s kulturou a inkubujte ji opatrně.

Křehkost buněčných kultur nelze přeceňovat. Silné třepání, stálé vibrace nebo neustálé kolísání teploty mohou nepříznivým způsobem ovlivnit růstový vzor. Ujistěte se, že inkubátor je vodorovný, s rovnoměrným teplotním profilem a mimo motorizované nástroje. Kromě toho je třeba se vyhnout manipulaci s více buněčnými liniemi najednou, protože by to mohlo ohrozit genotyp a fenotyp vašich buněk. Pro zaručení nebo potvrzení identity buněčných linií by se také mělo pravidelně provádět profilování STR.

3. Před použitím kryokonzervované buňky řádně rozmrazte.

I když se rozmrazování může zdát jako základní krok, je nezbytné, aby bylo provedeno správně, aby nedošlo k poškození buněk. Dlouhodobé vystavení teplu a odstřeďování znemožňuje nanesení buněk. Proto by měla být kryozkumavka umístěna do vodní lázně o teplotě 37 °C po dobu přibližně dvou minut a poté by měla být zředěna v upraveném médiu, aby se zabránilo bezprostřednímu poškození způsobenému DMSO.

4. Použijte aktivně rostoucí buňky, které jsou v log fázi růstu.

Proces buněčné kultivace má 3 fáze. Fáze zpoždění, log fáze a fáze plateau představují nízký buněčný růst, vysoký buněčný růst a žádný buněčný růst. Nejživotaschopnější buňky jsou zdravé a rychle se dělící a dochází k nim při asi 70-80% konfluenci v srdci log fáze.

5. Před pasáží nedovolte, aby buňky dosáhly úplného konfluence.

Konfluence se týká podílu adherentních buněk k nepokryté povrchové ploše v baňce. Kompletní konfluence znamená, že 100 % povrchu je pokryto adherentními buňkami. Je důležité se tomuto stavu vyhnout, protože představuje neschopnost buněk pokračovat v růstu. Je však nezbytné pokračovat v používání aktivně rostoucích buněk.

6. Vyberte nejlepší strategii rozvoje médií.

V buněčné kultuře je médium velmi důležitým faktorem při řízení kvality produktu, výtěžku a nákladů. Je důležité, aby média byla přizpůsobena každé kultuře, aby se optimalizovala účinnost a výsledky experimentu. Při rozhodování, jakým způsobem vyvinout svá média, máte na výběr z několika možností. Můžete si koupit volně prodejná média, vyvinout média v laboratoři, spolupracovat s jinou společností na vývoji specifičtějších médií nebo kombinaci čehokoli z toho. Některé faktory, které je třeba vzít v úvahu při výběru strategie vývoje, zahrnují časovou osu, náklady na materiály a fázi vývoje produktu.

7. Při vkládání suchých práškových médií do roztoku zhodnoťte kvalitu vody.

Kapalná média od výrobce mají tendenci poskytovat kvalitnější výsledky než roztok suchých práškových médií (DPM). To lze přičíst kvalitě vody v laboratoři komerční mediální společnosti. Vzhledem k rychlému růstu bakterií ve vodě je důležité sledovat endotoxiny a další kontaminanty. Komerční společnosti mají prostředky k monitorování a kontrole růstu bakterií, jako jsou bakteriální filtry a kulové mlýny. Je proto spolehlivější používat tekutá média vyrobená výrobcem.

8. Manipulujte s charakteristikami buněčného metabolismu za účelem optimalizace média.

Analýza použitého média může pomoci identifikovat rychlost metabolismu životně důležitých složek média včetně aminokyselin a vitamínů. Dynamické metabolické profily shromážděné z buněčné růstové fáze a stacionární produkční fáze mohou být využity pro stechiometrickou rovnováhu základního a napájecího média, nasměrování zaměření média na specifickou reakci a změnu poměru tvorby biomasy k produkci proteinu.

9. Vyhněte se nadměrné trypsinizaci buněk.

Trypsin je proteolytický enzym, který umožňuje průchod adherentních buněk štěpením proteinů odpovědných za vazbu buněk k cévě. Pokud buňky zůstanou vystaveny trypsinu příliš dlouho, začne štěpit proteiny buněčného povrchu, což ovlivní schopnost buňky správně fungovat.

10. Nepoužívejte důsledně antibiotika v kultivačním médiu.

Jak je buněčná kultura vystavena antibiotikům častěji, začnou se vyvíjet kmeny s vrozenou rezistencí vůči antibiotikům. Takový jev může maskovat základní kontaminaci, což by mohlo být extrémně škodlivé pro experiment.