Často kladené otázky o lyofilizaci a rekonstituci bílkovin

1. Proč je potřeba proteiny lyofilizovat? 

Proteiny jsou citlivé na teplo a lyofilizace zachovává většinu proteinové aktivity, zlepšuje stabilitu proteinu a skladovatelnost a snižuje náklady na dopravu.

2. Jaké jsou účinky lyofilizace na proteiny?

Lyofilizace může způsobit částečnou ztrátu aktivity proteinu, agregaci a další problémy s denaturací. Tyto negativní účinky však lze minimalizovat přidáním ochranných činidel před lyofilizací a kontrolou teploty a tlaku lyofilizace.

3. Jaké jsou běžně používané lyofilizační ochranné prostředky? 

Ochranné látky jsou ochranné látky používané k ochraně proteinu během lyofilizace a skladování. Běžně používané ochranné látky nebo stabilizátory jsou cukry, jako je mannitol, trehalóza, sacharóza, glukóza nebo laktóza. Látky chránící před lyofilizací významně zabraňují změnám sekundární struktury proteinu, jakož i natahování a agregaci proteinu během lyofilizace nebo po lyofilizaci.

4. Jak rekonstituuji sušený proteinový prášek? Mám přidat sterilní vodu nebo PBS pro opětovné rozpuštění?

Jako rozpouštědlo doporučujeme použít čistou, sterilní vodu. Přidejte čištěnou vodu do doporučeného objemu a jemně protřepejte nádobou, aby se protein úplně a rovnoměrně rozpustil. PBS lze také použít jako rekonstituční pufr, protože sůl v PBS může být v rekonstitučním systému zanedbatelná. 

5. Proč některé pokyny pro lyofilizované protilátky ukazují skladovací roztok a koncentraci?

U mnoha protilátkových produktů to není špatné označení. Skladovací roztok a koncentrace zde označené odkazují na podmínky skladování protilátky předtím, než se z ní vytvoří lyofilizovaný prášek. Například skladovacím roztokem před lyofilizací je typicky sterilní PBS pufr o pH 7,4 s koncentrací 1 mg/ml. Jakmile obdržíte protilátkový produkt, můžete jej snadno rekonstituovat přidáním odpovídajícího objemu (hmotnost/kon.) sterilní vody. To povede k tomu, že podmínky skladování rekonstituované protilátky budou stejné jako před lyofilizací. Kromě toho výrobci protilátek obvykle poskytují doporučené faktory ředění pro aplikace dané protilátky, které jsou založeny na původní koncentraci protilátky před lyofilizací.

6. Opatření pro rekonstituci a skladování protilátek

Předpokládejme, že skladovací roztok neobsahuje bovinní sérový albumin (BSA) a konzervační látky, jako je azid sodný. V takovém případě může být protilátka rekonstituována s vhodným množstvím BSA pro udržení stability protilátky a konečné koncentrace 0,02 % (w/v) azidu sodného, ​​aby se zabránilo mikrobiální kontaminaci protilátky. Navíc lze přidat glycerol jako kryoprotektivní činidlo, aby se zabránilo poškození mrazem a rozmrazováním.

Tyto složky však mohou interferovat s účinností navázání protilátky na fluorescenční barviva, kovy a enzymy. BSA může soutěžit s primární protilátkou o navázání konjugátu, což významně snižuje účinnost vazby. Azid sodný je cytotoxický, což omezuje použití protilátek v živých buňkách nebo studiích in vivo a může také inhibovat aktivitu enzymu, což může bránit navázání protilátek. 

 Proto je důležité ověřit, že složky přidané do skladovacího roztoku nezhoršují následnou aplikaci a stabilitu protilátky.